Đạo diễn Tuấn Khôi được khán giả biết đến đầu tiên vào khoảng đầu những năm 1992 – 1994 với vai trò diễn viên trong vở hài kịch Đứa con tiền kiếp của đạo diễn nhà giáo ưu tú Nguyễn Văn Phúc.
Sau khi tốt nghiệp khoa diễn viên trường Đại học Sân khấu Điện ảnh TP. Hồ Chí Minh, anh công tác tại sân khấu 5B Võ Văn Tần, rồi và nhiều sân khấu khác, tham gia diễn xuất trong nhiều vở diễn như: Tấm Cám, Trái tim nhảy múa, Cậu đồng, Ngàn năm tình sử…
Với mong muốn gắn bó nghề hơn nữa, anh học lên đạo diễn và đã có những vở diễn ăn khách tại sân khấu như: Người đàn bà không ngủ, Yêu đi thôi, Cưới vợ cho ai, Cuộc chơi nghiệt ngã, Xóm vịt trời, Tấm da hổ, Tứ đại mĩ nhân…